Kiểm tra PCR

Maximilian Reindl nghiên cứu hóa học và sinh hóa tại LMU ở Munich và là thành viên của nhóm biên tập kể từ tháng 12 năm 2020. Anh ấy sẽ tự làm quen với các chủ đề y tế, khoa học và chính sách sức khỏe cho bạn để làm cho chúng dễ hiểu và dễ hiểu.

Các bài viết khác của Maximilian Reindl Tất cả nội dung của đều được kiểm tra bởi các nhà báo y tế.

Xét nghiệm PCR đã trở thành một phần không thể thiếu trong y học hiện đại và chẩn đoán phân tử. Bởi vì chúng rất chính xác, chúng được coi là "tiêu chuẩn vàng". Chúng có thể được sử dụng trong nhiều ứng dụng, từ phát hiện mầm bệnh đến sàng lọc các bệnh di truyền - tức là bất cứ nơi nào cần thiết để phát hiện một cách đáng tin cậy ngay cả những dấu vết nhỏ nhất của vật chất di truyền. Tìm hiểu tại đây tại sao xét nghiệm PCR lại chính xác đến vậy, nó được sử dụng ở đâu và cách thức hoạt động chi tiết.

Xét nghiệm PCR là gì?

Xét nghiệm PCR là một phương pháp trong phòng thí nghiệm từ sinh học phân tử và y học. Thử nghiệm được sử dụng để phát hiện trực tiếp - và xác định đặc tính - của vật liệu di truyền. Phương pháp PCR được các chuyên gia đánh giá là dễ thực hiện, có thể áp dụng rộng rãi và hiệu quả.

Trong phòng thí nghiệm, xét nghiệm PCR bao gồm hai bước. Trong bước đầu tiên, vật liệu di truyền hiện có được tái tạo với sự hỗ trợ của phản ứng chuỗi polymerase, viết tắt là PCR. Bằng cách này, những dấu vết nhỏ nhất của DNA có thể được kiểm tra. Đây cũng là lý do tại sao xét nghiệm PCR rất nhạy cảm.

Trong bước thứ hai, vật liệu di truyền được tách ra, “sắp xếp” và do đó được đặc trưng theo các đặc tính của nó. Vì vậy, cấu trúc tốt của DNA được xác định.

Có nhiều cách sử dụng: Các bác sĩ sử dụng xét nghiệm PCR để kiểm tra, ví dụ như phết tế bào coronavirus, hiến máu để tìm HIV hoặc sàng lọc trẻ sơ sinh để tìm các bệnh di truyền có thể xảy ra. Nhiễm trùng do vi khuẩn - ví dụ với mầm bệnh lao - hoặc nhiễm ký sinh trùng (sốt rét) cũng có thể được làm rõ bằng PCR.

Họ cũng giúp đỡ trong pháp y để kết tội người phạm tội dựa trên dấu vân tay di truyền của họ hoặc được sử dụng làm xét nghiệm quan hệ cha con.

Tất cả các ứng dụng này được tóm tắt dưới thuật ngữ chẩn đoán phân tử. Do đó, PCR có ứng dụng thực tế trong nghiên cứu, chẩn đoán và pháp y vượt xa việc phát hiện mầm bệnh Sars-CoV-2.

(Corona) Thử nghiệm PCR so với thử nghiệm PCR nhanh

Thông thường, việc đánh giá xét nghiệm PCR diễn ra trong phòng thí nghiệm chuyên biệt. Điều này có nghĩa là vật liệu mẫu được gửi đến và kiểm tra ở đó. Kết quả thường nhận được sau đó vài ngày.

Nhiều công ty khởi nghiệp khác nhau (GNA Biosolutions, Spindiag) gần đây đã giới thiệu các loại thiết bị thử nghiệm di động mới. Đối với điều này, họ cũng đã nhận được sự chấp thuận đặc biệt từ Viện Liên bang về Thuốc và Thiết bị Y tế (BfArM). Với sự trợ giúp của các thiết bị xét nghiệm PCR di động này, xét nghiệm PCR cũng có thể thực hiện được mà không cần phòng thí nghiệm chuyên dụng.

Cách tiếp cận này có tiềm năng rất lớn, vì kết quả xét nghiệm đáng tin cậy có thể có trong vòng vài giờ trực tiếp tại địa điểm lấy mẫu (trung tâm xét nghiệm).

Hiện vẫn chưa thể đánh giá được mức độ mà các hệ thống xét nghiệm PCR nhanh như vậy sẽ phổ biến trong thực tế. Hiện vẫn chưa rõ các trung tâm kiểm tra sẽ được cung cấp các thiết bị này trên diện rộng nhanh như thế nào.

Do đó, trong tương lai gần, các xét nghiệm PCR dựa trên phòng thí nghiệm “thông thường” sẽ tiếp tục được thực hiện, điều này gây ra sự chậm trễ nhất định giữa việc lấy mẫu và kết quả xét nghiệm.

Làm thế nào đáng tin cậy là một xét nghiệm PCR?

PCR là một phương pháp phát hiện đã được chứng minh trong chẩn đoán phân tử và y học. Nó được coi là cái gọi là bản vị vàng với tỷ lệ sai số rất thấp. Các xét nghiệm này đặc biệt được đặc trưng bởi độ nhạy và độ đặc hiệu rất cao.

Độ nhạy có nghĩa là độ tin cậy mà xét nghiệm tìm thấy vật liệu di truyền được phát hiện.

Tính đặc hiệu có nghĩa là sự chắc chắn mà xét nghiệm xác định rằng vật liệu di truyền được đề cập không có trong mẫu.

Khi nào các xét nghiệm PCR hoạt động trong trường hợp nhiễm trùng Sars CoV-2?

Theo quy định, xét nghiệm PCR phát hiện nhiễm trùng hào quang từ hai đến ba ngày trước và tối đa 20 ngày sau khi bắt đầu xuất hiện các triệu chứng. Ngay cả với những người bị nhiễm bệnh vẫn hoàn toàn không có triệu chứng, xét nghiệm vẫn hoạt động trong một khoảng thời gian quan trọng khi họ có thể lây nhiễm cho người khác.

Trong một số trường hợp, bằng chứng về điều này thậm chí có thể thực hiện được sau 60 ngày kể từ khi các triệu chứng của bệnh xuất hiện.

Vào ngày đầu tiên sau khi nhiễm trùng corona, xét nghiệm PCR cũng có thể cho kết quả âm tính, mặc dù đã có nhiễm trùng. Trong trường hợp như vậy, không có đủ vi rút trong cổ họng tại thời điểm xét nghiệm phết tế bào. Tuy nhiên, nếu có nghi ngờ nhiễm trùng hợp lý, các bác sĩ thường tiến hành xét nghiệm PCR khác vào những ngày tiếp theo.

các nguồn có thể xảy ra lỗi

Tỷ lệ sai sót trong quá trình sao chép DNA là không đáng kể trong thực tế. Mặc dù các polymerase DNA không bao giờ hoạt động bình thường, nhưng chúng hầu như không đóng một vai trò nào trong quá trình xét nghiệm PCR.

Trên thực tế, các nguồn sai sót có thể xảy ra nằm trong quá trình lấy mẫu: Do đó, điều quan trọng là nhân viên y tế được đào tạo phải thực hiện các vết bẩn. Các mẫu nước bọt và nước súc miệng có thể làm giảm độ chính xác, do hiệu ứng pha loãng xảy ra ở đây.

Xét nghiệm PCR hoạt động như thế nào?

Ví dụ, một xét nghiệm PCR được thực hiện bởi bác sĩ gia đình hoặc tại các trung tâm xét nghiệm đặc biệt. Đầu tiên, bác sĩ hoặc các chuyên gia chăm sóc sức khỏe được đào tạo sẽ lấy mẫu. Thông thường, một miếng gạc được lấy từ đường thở trên để làm xét nghiệm. Điều này thường xảy ra dưới hình thức ngoáy miệng hoặc ngoáy mũi họng.

Cũng có thể súc miệng bằng dung dịch súc miệng. Một mẫu máu không điển hình để phát hiện hào quang - nhưng phổ biến, ví dụ, trong sàng lọc sơ sinh.

Bất kể loại mẫu được lấy là gì, vật liệu di truyền được tìm thấy trên tăm bông, trong dung dịch rửa hoặc trong một giọt máu. Nguyên liệu mẫu này được gửi đến phòng thí nghiệm, nơi nó được phân lập và tinh chế.

Xét nghiệm PCR sau đó được chia thành hai bước:

• PCR: Trong bước này, số lượng vật liệu di truyền ban đầu được nhân lên.
• Điện di: Trong bước thứ hai, các đoạn gen được "sắp xếp" theo kích thước. Bằng cách này, mẫu có thể được đặc trưng - cấu trúc tốt của vật liệu di truyền được xác định.

Bước 1: PCR - "Phản ứng chuỗi polymerase"

"PCR" là bước đầu tiên trong số hai bước làm việc: Tại đây, số lượng DNA ban đầu hiện có được nhân lên. Bởi vì chỉ khi vật liệu di truyền có đủ số lượng thì mới có thể kiểm tra được. Chủ yếu đây là DNA của con người; các xét nghiệm cho coronavirus theo đó là RNA của vi rút.

Viết tắt PCR là viết tắt của thuật ngữ tiếng Anh “Polymerase Chain Reaction”.

Những gì cần thiết cho một PCR?

DNA khởi đầu nằm trong một bình phản ứng với các chất đặc biệt. Vật liệu di truyền hiện có đóng vai trò như một khuôn mẫu, được sao chép với sự hiện diện của một số enzym (Taq polymerase) và một số khối xây dựng DNA cơ bản nhất định.

Quá trình sao chép diễn ra trong nhiều lần chạy (chu kỳ) lặp đi lặp lại.

Cụ thể, các chất sau đây được kết hợp với nhau:

• DNA khởi đầu: vật liệu mẫu cần được sao chép.
• Các khối xây dựng DNA cơ bản: Đây là các nucleobase adenine, thymine, cytosine và guanine.
• DNA polymerase: Một loại enzyme liên kết các khối xây dựng DNA riêng lẻ để tạo thành một chuỗi DNA được xác định rõ. Sợi mới thu được là hình ảnh được phản chiếu (bổ sung) của nguyên liệu ban đầu ban đầu.
• Dung dịch đệm: Phản ứng chuỗi polymerase diễn ra trong dung dịch đệm sinh lý. Điều này đảm bảo các điều kiện tương tự như các điều kiện được tìm thấy trong tế bào người. Dung dịch này giữ cho độ pH ổn định và cũng chứa các ion magiê. Các điều kiện được kiểm soát này là cần thiết để đảm bảo chức năng của DNA polymerase.
• Mồi: Chúng bao gồm 16 đến 24 cặp cơ sở và đóng vai trò là vị trí bắt đầu và tín hiệu khởi động. Các đoạn mồi cho thấy DNA polymerase tại thời điểm đó (của DNA bắt đầu) quá trình sao chép bắt đầu.

Xét nghiệm PCR được thực hiện như thế nào?

Vì tất cả các chất cần thiết cho PCR hiện đã ở trong bình phản ứng, nên quá trình sao chép thực tế của vật liệu di truyền có thể bắt đầu. Điều này chỉ được bắt đầu, kiểm soát và dừng lại bởi nhiệt độ.

Do đó, bình phản ứng được làm nóng hoặc làm lạnh theo cách có mục tiêu đến các nhiệt độ khác nhau. Điều này được thực hiện với một thiết bị đặc biệt - cái gọi là bộ tuần hoàn nhiệt. Phản ứng tổng thể mất khoảng một đến hai giờ.

Các bước riêng lẻ của một chu kỳ PCR là:

• Biến tính các sợi kép DNA: Mẫu được làm nóng đến khoảng 90 độ C. Kết quả là, sợi kép DNA ban đầu bị đứt thành hai sợi đơn riêng biệt (bổ sung).
• Đính kèm lớp sơn lót: Hạ nhiệt độ xuống dưới 60 độ C. Kết quả là các đoạn mồi (mồi thuận, mồi ngược) gắn vào các vị trí xác định trên các sợi đơn tương ứng của ADN.
• Mở rộng: Nhiệt độ được tăng lên trên 70 độ C. DNA polymerase bây giờ bắt đầu hoạt động ở nhiệt độ tối ưu này. Nó gắn vào các vị trí mồi và kéo dài sợi đơn ban đầu của DNA từng bước cho đến khi có một bản sao chính xác (bổ sung) (tổng hợp DNA).

Sau một chu kỳ hoàn thành, nhiệt độ lại tăng lên khoảng 90 độ C - chu kỳ bắt đầu lại từ đầu.

Sử dụng phương pháp PCR, trình tự DNA có thể được sao chép lên đến khoảng ba cặp kilobase (kbp). Điều này tương ứng với khoảng 3.000 khối xây dựng DNA cơ bản được liên kết để tạo thành một “chuỗi”. Để so sánh: bộ gen người lưu trữ các bản thiết kế và thông tin cho hoạt động của tế bào trong khoảng ba tỷ cặp cơ sở - mặt khác, bộ gen coronavirus bao gồm 30.000 cặp cơ sở. Xét nghiệm PCR chỉ có thể được sử dụng để tái tạo và kiểm tra các đoạn ngắn của tổng số DNA.

Các lớp sơn lót rất quan trọng

Việc lựa chọn mồi là rất quan trọng đối với quá trình PCR. Ví dụ, trong chẩn đoán Sars-CoV-2, một số mồi được sử dụng (multiplex PCR).

Các xét nghiệm PCR Corona tìm kiếm ba gen virus khác nhau: Độ đặc hiệu tổng thể tăng lên gần 99,99%. Điều này có nghĩa là với tỷ lệ trúng đích cao này, chỉ có một lần xét nghiệm dương tính giả trên 10.000 lần xét nghiệm (nếu mẫu được lấy chính xác).

Hiện nay có bao nhiêu vật chất di truyền được sao chép?

Giả sử sau chu kỳ thứ nhất có hai chuỗi kép ADN giống nhau.

Sau mỗi chu kỳ, số lượng vật chất di truyền (được sao chép) tăng gấp đôi. Vì vậy, số lượng DNA tăng lên theo cấp số nhân.

Nói cách khác: sau chu kỳ thứ hai có bốn sợi kép giống nhau - sau chu kỳ thứ ba là tám sợi kép - sau chu kỳ thứ tư 16 sợi kép và sau chu kỳ thứ năm đã có 32 sợi kép.

Các chuyên gia y tế thường lặp lại quá trình này khoảng 20 đến 30 lần.

Nói một cách ẩn dụ, điều này có nghĩa là: Ngay cả khi chỉ tìm thấy một sợi kép DNA duy nhất trong mẫu lúc đầu, thì sau hai mươi chu kỳ, sẽ có một triệu bản sao giống hệt nhau trong bình phản ứng.

Giá trị Ct có nghĩa là gì?

Số chu kỳ PCR đã hoàn thành được đưa ra dưới dạng cái gọi là giá trị Ct. “Ct” có nguồn gốc từ thuật ngữ tiếng Anh “ngưỡng chu kỳ”. Giá trị Ct này cho phép đưa ra các tuyên bố về số lượng vật liệu di truyền đang được tìm kiếm.

Ở giá trị Ct thấp 20, có rất nhiều vật chất di truyền ban đầu. Tuy nhiên, nếu giá trị Ct cao - khoảng 30 chu kỳ - thì tương ứng có ít DNA. Do đó, chu trình PCR phải được thực hiện thường xuyên hơn.

Bước 2: Điện di "Sắp xếp theo kích thước"

Cuối cùng, nếu có đủ vật liệu di truyền “được làm giàu”, quá trình điện di có thể diễn ra. Các nhà khoa học sử dụng một đặc tính nhất định của DNA: điện tích của nó.

Các khối xây dựng DNA riêng lẻ được liên kết với nhau thông qua xương sống đường-photphat tích điện (âm). Một chuỗi DNA nhất định càng dài thì điện tích của nó càng cao.

Nếu vật liệu di truyền được đặt trong một môi trường mang cụ thể (agarose) và một điện áp được đặt vào, các đoạn DNA bắt đầu di chuyển do điện tích của chúng. Vì đoạn DNA dài hơn di chuyển nhanh hơn đoạn ngắn hơn, chúng phân tách theo kích thước.

Bằng cách này, vật liệu di truyền có thể được kiểm tra và xác định đặc điểm. Trong thực tế, một mẫu chưa biết với tham chiếu đã biết thường được áp dụng cho "vạch xuất phát" và được so sánh với mẫu khác sau một khoảng thời gian nhất định.

Nếu "tốc độ di chuyển" là như nhau cho cả hai trình tự, điều này có nghĩa là: Việc phát hiện rất có thể là dương tính - gen bạn đang tìm kiếm có trong mẫu.

Trường hợp đặc biệt của Coronavirus: chuẩn bị mẫu và RT-PCR

Việc phát hiện mầm bệnh cho coronavirus là một trường hợp đặc biệt, Sars-CoV-2 là một trong những loại virus RNA. Điều này có nghĩa là bộ gen Sars-CoV-2 ở dạng ARN (axit ribonucleic).

RNA chỉ khác DNA ở một số điểm. Trong số những thứ khác, nó có sẵn dưới dạng một sợi đơn và dựa trên đường ribose thay vì 2 "deoxyribose. Thymine nucleobase cũng đã được thay thế bằng uracil làm cơ sở thứ tư.

RNA của virus này phải được "phiên mã" thành DNA trước khi xét nghiệm PCR thông thường. Quá trình này được gọi là phiên mã ngược (RT) - do đó có thuật ngữ RT-PCR. Trong quá trình này, một sợi cDNA đơn lẻ ("DNA bổ sung") sẽ được thu được. Trong một bước tiếp theo, sợi cDNA đơn được bổ sung bởi một sợi DNA ngược gương thứ hai.

Khi kết thúc quá trình chuẩn bị mẫu, có một sợi kép DNA tương ứng với bản thiết kế ban đầu của RNA virus: Chỉ sợi đôi này bây giờ có thể được sử dụng làm khuôn mẫu trong xét nghiệm PCR.

Mất bao lâu để có kết quả?

Sau khi gửi mẫu đến phòng thí nghiệm, bạn thường sẽ nhận được kết quả sau một hoặc hai ngày làm việc.Tại các trung tâm thử nghiệm, nơi thường kiểm tra các mẫu tại chỗ, việc này có thể chỉ mất vài giờ. Khoảng thời gian phụ thuộc phần lớn vào trung tâm khảo thí tương ứng và dịch vụ hậu cần của nó.

Bất chấp quy trình làm việc phức tạp, các phòng thí nghiệm hiện đại có thể thực hiện các xét nghiệm PCR với thông lượng cao. Các thiết bị tự động đặc biệt giúp thực hiện.

Xét nghiệm PCR vẫn được coi là một phương pháp tương đối "chậm" nhưng tất cả đều là phương pháp phát hiện đáng tin cậy hơn.

Điều gì xảy ra nếu kết quả là dương tính?

Nếu mẫu được lấy chính xác, kết quả xét nghiệm PCR dương tính có nghĩa là người được xét nghiệm rất có thể bị nhiễm Sars-CoV-2.

Nếu bạn đã được xác nhận là bị nhiễm coronavirus với sự trợ giúp của xét nghiệm PCR, bộ phận y tế sẽ nhận được thông báo từ phòng thí nghiệm tương ứng về kết quả xét nghiệm dương tính. Trong trường hợp như vậy, sở y tế sẽ ra lệnh cách ly hoặc cách ly.

Tôi có tự động lây nhiễm nếu tôi nhận được xét nghiệm PCR dương tính không?

Hầu hết thời gian, đúng thế. Nhưng không phải lúc nào cũng vậy. Kết quả của xét nghiệm PCR phải luôn được giải thích theo ngữ cảnh. Xét nghiệm dương tính chủ yếu có nghĩa là bạn có chất virus trong người.

Nếu bạn chỉ mới bị Covid 19 (vài ngày) gần đây, xét nghiệm PCR vẫn có thể cho kết quả dương tính - mặc dù bạn đã khỏe mạnh trở lại. Đây là một trường hợp đặc biệt và là nhược điểm của xét nghiệm có độ nhạy cao, vì nó cũng có thể phát hiện ra các đoạn vi rút không thể sinh sản.

Xét nghiệm kháng thể bổ sung đôi khi hữu ích

Trong những trường hợp như vậy, xét nghiệm kháng thể cung cấp sự chắc chắn đảm bảo tính hợp lệ của xét nghiệm PCR. Tốt nhất là thảo luận điều này với bác sĩ của bạn. Họ có thể giúp bạn diễn giải chính xác kết quả xét nghiệm PCR.

Phải làm gì nếu kết quả âm tính

Kết quả xét nghiệm PCR âm tính có nghĩa là với khả năng cao là bạn không bị nhiễm Covid-19 khi lấy mẫu và do đó hiện không lây nhiễm. Tuy nhiên, bạn có thể đang ở giai đoạn đầu của nhiễm trùng.

Thông thường, nhiễm trùng corona chỉ có thể được phát hiện từ ngày thứ hai hoặc thứ ba sau khi nhiễm trùng. Vì vậy, kết quả không phải là một vé miễn phí. Do đó, bạn nên tiếp tục tuân thủ các quy tắc về khoảng cách và vệ sinh và tiếp tục đeo khẩu trang FFP2 - vì chính bạn và để bảo vệ người khác.

Xét nghiệm PCR ở trẻ em

Xét nghiệm PCR ở trẻ em không khác gì xét nghiệm PCR dành cho người lớn. Cả việc lấy mẫu và giải thích kết quả đều áp dụng cho cả trẻ em và người lớn.

Những rủi ro của xét nghiệm PCR là gì?

Xét nghiệm PCR không có rủi ro vật lý. Chỉ có một số người cho rằng việc lấy mẫu bằng tăm bông mũi họng là khó chịu hoặc khó chịu.

Chi phí xét nghiệm PCR là bao nhiêu?

Mọi chi phí phát sinh cho xét nghiệm PCR sẽ được đài thọ nếu các bác sĩ điều trị của bạn hoặc sở y tế chấp thuận xét nghiệm đó. Việc hoàn trả chi phí thường được xem xét nếu bạn đã có các triệu chứng của riêng mình hoặc bạn đã tiếp xúc trực tiếp với những người bị nhiễm bệnh.

Ngay cả trong trường hợp kết quả xét nghiệm nhanh hoặc tự xét nghiệm dương tính, bạn vẫn có quyền xét nghiệm PCR miễn phí.

Xin lưu ý: Nếu bạn đã tự xét nghiệm tại nhà và nhận được kết quả dương tính, bạn nên đặt lịch hẹn với bác sĩ gia đình ngay lập tức qua điện thoại. Bác sĩ chăm sóc của bạn sẽ thảo luận về thủ tục thêm với bạn qua điện thoại.

Ngoài ra, cách tốt nhất là gọi 116 117 để đăng ký xét nghiệm PCR. Cho đến khi kiểm tra xác nhận, lý tưởng là bạn nên ở nhà để bảo vệ bản thân và những người khác.

Tags.:  thuốc giảm đau tạp chí nơi làm việc lành mạnh